楊輝, 馬修兵, 孫彥飛, 王鐵棟, 慶豐, 趙雪松. 小型熒光激光雷達(dá)測(cè)量六種典型生物戰(zhàn)劑模擬物二維熒 光光譜[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2019,39(3): 802-806.

YANG Hui, MA Xiu-bing, SUN Yan-fei, WANG Tie-dong, QING Feng, ZHAO Xue-song. 2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range   Lidar[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(3): 802-806.

Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)03-0802-05 Permissions

小型熒光激光雷達(dá)測(cè)量六種典型生物戰(zhàn)劑模擬物二維熒光光譜

楊輝 1  , 馬修兵 2, 孫彥飛 1, 王鐵棟 1, 慶豐 1, 趙雪松 3 摘要

關(guān)鍵詞: 生物戰(zhàn)劑; 模擬物; 近場(chǎng)熒光激光雷達(dá); 導(dǎo)數(shù)熒光光譜 中圖分類號(hào):TN247 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range Lidar

YANG Hui1, MA Xiu-bing2, SUN Yan-fei1, WANG Tie-dong1, QING Feng1, ZHAO Xue-song3

Abstract

Keyword : Bioagents; Simulants; Short range fluorescence lidar; Derivative fluorescence spectra

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引 言

生物戰(zhàn)劑在大氣中的散布能對(duì)軍民用設(shè)施和人員造成極大的危害,  目前缺乏切實(shí)有效的探測(cè)和識(shí)別 手段[1] 。 對(duì)生物戰(zhàn)劑的遙測(cè)和先期預(yù)警, 避免和減少人員、 設(shè)施和裝備傷亡, 尤為重要。 在光學(xué)生物

戰(zhàn)劑遙感領(lǐng)域, UV-LIF 在探測(cè)和識(shí)別方面發(fā)展迅速。 原則上, 蛋白質(zhì)、 病毒、 細(xì)菌和其他生物有機(jī) 物, 至少含有一種以上的熒光團(tuán), 可以在特定紫外光的激勵(lì)下發(fā)射出熒光, 且這些生物物質(zhì)發(fā)出的熒光，與其所含生物熒光團(tuán)的特定分子結(jié)構(gòu)、 外部環(huán)境或溶質(zhì)的物化特性等密切相關(guān), 因而在熒光譜特征方面 表現(xiàn)出極大的差異性[2,3]。

成團(tuán)泛菌 Pantoea agglomerans(Pan)原名草生歐氏桿菌是植物體上常見(jiàn)的附生菌, 是土拉桿菌  的模擬物; 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(Sta)是一種重要的條件致病菌, 廣泛分布于自然  界, 可以引起人和動(dòng)物的軟組織感染, 并可導(dǎo)致生命威脅的肺炎、 菌血癥及包括心內(nèi)膜炎、 膿毒性關(guān)節(jié) 炎、 骨髓炎等的嚴(yán)重并發(fā)癥, 還能引發(fā)食物中毒及中毒性休克綜合癥等,  占社區(qū)和醫(yī)院感染源的 60%和 80%; 大腸桿菌 Escherichia coli(EH)廣泛分布于自然界, 包括腐生菌、 寄生菌和人及動(dòng)物的病原菌,   多數(shù)是人和動(dòng)物腸道正常菌群的重要成員, 1949 年— 1969 年的 20 年間, 美國(guó)在狄特里克堡試驗(yàn)  場(chǎng)、 道格威試驗(yàn)場(chǎng)和化學(xué)中心等 34 個(gè)非公共場(chǎng)大約進(jìn)行了 108 次曲霉菌和大腸桿菌模擬生物戰(zhàn)劑 測(cè)試; 球芽孢桿菌 Bacillus globigii(BG)是炭蛆桿菌的非致病性模擬物, 其孢子形態(tài)形狀與炭蛆桿菌極  為相近, 休眠態(tài)孢子可以抵御多數(shù)苛刻惡劣的外部環(huán)境, 在環(huán)境適宜時(shí)則迅速生長(zhǎng)。 2000 年前后的數(shù)十 年, 加拿大國(guó)防部, 就一直持續(xù)地將球芽孢桿菌作為炭疽桿菌進(jìn)行研究。 成團(tuán)泛菌、 大腸桿菌為革蘭氏 陰性桿菌, 球芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌。

數(shù)十年來(lái), 大多數(shù)學(xué)者都將工作聚焦在生物戰(zhàn)劑光學(xué)(如熒光, 磷光)遙測(cè)領(lǐng)域, 極少對(duì)生物戰(zhàn)劑模  擬物的選擇, 培養(yǎng)及熒光光譜等方面的研究進(jìn)行報(bào)道[4,5,6,7,8] 。 本工作對(duì)成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌四種常見(jiàn)的細(xì)菌類生物戰(zhàn)劑模擬物[9]的培養(yǎng)和熒光光譜測(cè)定, 以及兩種毒素 類生物戰(zhàn)劑模擬物的熒光光譜測(cè)定情況進(jìn)行了報(bào)道, 對(duì)光譜特征進(jìn)行了分析, 并討論了光譜指紋特征的抽 取方法, 為生物戰(zhàn)劑熒光光譜特征數(shù)據(jù)庫(kù)的建立, 打下了基礎(chǔ)。

1 材料及熒光測(cè)量平臺(tái)

1.1 生物戰(zhàn)劑模擬物

選取了四種典型細(xì)菌類生物戰(zhàn)劑模擬物和兩種毒素類生物戰(zhàn)劑模擬物, 其中, 細(xì)菌類模擬物為成團(tuán) 泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種Staphylococcus aureus subsp. Aureus(Sta)、 大腸桿菌(大腸埃 希氏菌)和球芽孢桿菌, 毒素類模擬物為牛血清 BSA 和卵清蛋白 OVA。 BSA 和OVA 均來(lái)自 Sigma

Aldrich, 成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種、 大腸桿菌(大腸埃希氏菌)和球(芽孢)桿菌均購(gòu)自中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心, 編號(hào)分別為 CGMCC 1.4006, CGMCC 1.128, CGMCC  1.2812 和 CGMCC 1.1202。

1.2 菌種復(fù)壯與培養(yǎng)

用浸過(guò) 75%酒精的脫脂棉嚴(yán)格消毒冷凍管, 在超凈臺(tái)( 型號(hào) SW-CJ-1D)無(wú)菌環(huán)境中旋  開裝有復(fù)溶液的滴瓶蓋, 取約 1 mL 復(fù)溶液, 加入到冷凍管中, 輕輕振蕩, 使凍干菌株溶解呈懸浮狀。 用 無(wú)菌吸管吸取菌懸液, 轉(zhuǎn)移到復(fù)溶液滴瓶中。 做好標(biāo)識(shí), 在 HNY-2102C 立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(天津歐   諾)中適宜溫度下培養(yǎng)。 成團(tuán)泛菌和大腸桿菌的培養(yǎng)基為 LB 培養(yǎng)基, 金黃色葡萄球菌和球芽孢桿菌的培  養(yǎng)基為 TSB 培養(yǎng)基, 配制好后用高壓蒸汽滅菌 17 min。 TSB, LB 培養(yǎng)基的 pH 測(cè)定和調(diào)節(jié)由 pH 計(jì)

(Sartorius, 型號(hào) PB-10)完成。 成團(tuán)泛菌和球芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為 30 ℃, 金黃色葡萄球菌和大腸桿 菌的培養(yǎng)溫度為 37 ℃。

1.3 熒光測(cè)量平臺(tái)

熒光物質(zhì)在紫外激光的激勵(lì)下, 會(huì)輻射出寬譜熒光, 不便于類型的識(shí)別。 為提高類型辨識(shí)能力, 激 光器輸出的 3 倍頻 355 nm、 4 倍頻 266 nm 波長(zhǎng)激光, 分別用于氨基酸熒光分子、 NADH 和維生素 B 熒光的熒光和偏振測(cè)量, 355 和 266 nm 兩個(gè)波長(zhǎng)的激光能量脈寬均為 5 ns, 脈沖能量約為 5 mJ, 重復(fù)頻率為 10 Hz。 熒光信號(hào)由 400 mm 口徑的牛頓型望遠(yuǎn)鏡收集, 并由光譜儀進(jìn)行分析, 其分辯率為  2/4 nm。 熒光的探測(cè)范圍為 250650 nm, 探測(cè)距離不小于 20 m。 圖 1 為近場(chǎng)激光雷達(dá)的熒光測(cè)量 原理圖。

2 四種菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

2.1 樣品準(zhǔn)備和測(cè)定方法

在振蕩培養(yǎng)箱里, 對(duì)成團(tuán)泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌等四種典型細(xì)菌類生物戰(zhàn)劑模擬物進(jìn)行了 28 h 的平行培養(yǎng)。然后, 在超凈臺(tái)中按無(wú)菌操作進(jìn)行菌液準(zhǔn)備, 即取已經(jīng)劃過(guò)線的固體培養(yǎng)基, 用無(wú)菌牙簽沾取少量的菌體置于含有約50 mL 的液體TSB 或LB 培養(yǎng)液中, 放置于30 ℃/37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi), 每隔2H分別吸取成團(tuán)泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1 mL, 并用10 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成菌懸液, 用UV1102 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定四種菌液在600 nm 波長(zhǎng)上的吸光度, 用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液作為空白參比, 記錄四種菌液的吸光度值OD。OD 測(cè)量均重復(fù)三次, 直至菌液OD 值達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。

2.2 吸光度測(cè)量結(jié)果及討論

從細(xì)菌復(fù)活后的芽孢態(tài)開始, 分別對(duì)各菌不同生長(zhǎng)時(shí)期的吸光度值進(jìn)行了三次重復(fù)測(cè)定, 得到了各菌的生長(zhǎng)線。由圖2 可知：

(1)在設(shè)定的培養(yǎng)條件下, 四種菌的生長(zhǎng)階段較為明顯, 主要有萌發(fā)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期和衰亡期。 其中, 球芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌兩種菌的萌發(fā)期較短, 可能是菌種培養(yǎng)環(huán)境與現(xiàn)有培養(yǎng)環(huán)境相近, 在培養(yǎng)初期溶氧和酸堿度都較為適宜, 菌種極快地適應(yīng)了新環(huán)境并對(duì)數(shù)生長(zhǎng); 球芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)約4 h, 從第4 小時(shí)后到第24 小時(shí)結(jié)束為過(guò)渡平穩(wěn)期, 之后進(jìn)入穩(wěn)定平穩(wěn)期。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的萌發(fā)期相對(duì)較長(zhǎng), 約為15 小時(shí)和6 小時(shí); 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分別為2 和6 h。成團(tuán)泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌的代時(shí)分別為0.99, 0.835, 1.07  和 1.909 h。

(2)只有大腸桿菌有明顯的衰亡期, 在約5 h 的平衡期后, 大腸桿菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng), 有些大腸桿菌死亡, 吸收率隨即開始衰減, 其整個(gè)生命周期呈“ J” 型; 說(shuō)明細(xì)菌的培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線受遺傳性、 接種量和培養(yǎng)條件等因素的影響, 會(huì)有所變化。

3 熒光光譜測(cè)量

3.1 液態(tài)氣溶膠準(zhǔn)備

BSA 和OVA 氣溶膠配制: 在超凈臺(tái)用去離子水 ddH2O 稀釋, 得到的溶液濃度約為 1.0× 106和5.0× 106 個(gè) · mL-1, 搖勻后4 ℃靜置 10 min, 熒光待測(cè)。

成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌氣溶膠配制: 在超凈臺(tái)分別汲取過(guò)夜培養(yǎng)(約 24 h)后的 Pan, Sta 和 BG 菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉(zhuǎn)速下離 心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測(cè)。

大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌氣溶膠配制: 在超凈臺(tái)分別汲取 15 h 培養(yǎng)后的菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理 鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉(zhuǎn)速下離心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽 水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測(cè)。

3.2 熒光測(cè)量方法

熒光測(cè)量在距離激光雷達(dá)約 20 m 的噴霧型測(cè)量腔中進(jìn)行。 氣溶膠室長(zhǎng) 15 m, 尺度為 2.0 m × 2.0 m。 兩端配有活動(dòng)門, 掛起時(shí)可以關(guān)閉, 放下時(shí)打開。 測(cè)量方法: (1)室門關(guān)閉, 將選定的 BSA、OVA、 成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)氣溶膠, 在數(shù)秒時(shí)間內(nèi)利用氣流式 霧化器和風(fēng)扇, 充分混合均勻, 并保留 10 s 以確保室內(nèi)具有良好的各向同質(zhì)性; (2)然后打開腔前門, 用 激光雷達(dá)完成熒光測(cè)量; (3)激光雷達(dá)數(shù)據(jù)采集結(jié)束后, 打開后門, 在數(shù)分鐘內(nèi)清空測(cè)量腔中的氣溶膠;(4)測(cè)量腔中氣溶膠清空并紫外線滅菌后分別測(cè)量同等濃度超純水和生理鹽水的熒光背景信號(hào), 作為參比 扣除。

3.3 雷達(dá)回波的小波去噪和平滑

在激光回波檢測(cè)中使用的去噪方法有匹配濾波、平滑濾波等; 當(dāng)信號(hào)波形已知時(shí), 匹配濾波方法能 夠有效地實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè), 是輸出信噪比較大化意義上的線性濾波器, 但對(duì)于非平穩(wěn)的回波信號(hào)其性能會(huì)大 幅下降。 尤其是, 滑動(dòng)平均濾波只相當(dāng)于低通濾波器, 中值濾波降噪優(yōu)勢(shì)是消除孤立的噪聲, 當(dāng)信噪比很 低時(shí), 改善信噪比性能有限[9,10]。

熒光信號(hào)較 MIE 散射信號(hào)低數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí), 為盡可能地保留信號(hào)光譜的特征, 不能采用常規(guī)的平滑降 噪處理, 對(duì)激光雷達(dá)的原始 PRR 信號(hào), 采用了分解級(jí)數(shù)為 4 的 Daubechies(db4)小波基, 與滑動(dòng)平均方 法比較而言, 利用該小波去噪可以更好地保留了激光雷達(dá)回波信號(hào)的峰值特征。

3.4 2D 熒光發(fā)射譜和二階導(dǎo)數(shù)熒光發(fā)射譜

根據(jù)生長(zhǎng)曲線, 大腸桿菌取 15 h 菌液, 其他三種則是 24 h 菌液, 在熒光測(cè)量腔中進(jìn)行熒光和背景 測(cè)量。 去除信號(hào)中的拉曼和瑞利散射信號(hào)后, 經(jīng)歸一化, 得到了如圖 3 所示的各模擬物液態(tài)氣溶膠的二  維熒光發(fā)射譜。 經(jīng)與色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的本征二維熒光譜對(duì)比分析后, 可得到以下結(jié)論:

(1)BSA, OVA 以及成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌氣溶膠的二 維熒光譜分布、 譜形與色氨酸一致性較高, 熒光譜的半高寬 FWHM 為 60 nm, 說(shuō)明其主要成份為色氨 酸, 酪氨酸和苯丙氨酸的熒光貢獻(xiàn)基本為0;

(2)相對(duì)于色氨酸的 280/350 nm 本征熒光峰, 其他所有模擬物的熒光發(fā)射中心波長(zhǎng)均存在不程度 的紫移, 其中 OVA 和 BSA 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別紫移了 18 和 12 nm, 熒光峰位于 280/332 和280/338 nm; 金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、 球芽孢桿菌的熒光發(fā)射波長(zhǎng)紫移了 10, 16, 8 和 16 nm, 熒光峰位于 280/340, 280/336, 280/342 和 280/334 nm;

(3)僅利用單個(gè)或數(shù)個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)得到的發(fā)射譜, 要區(qū)分和識(shí)別不同生物物質(zhì), 較為不易。 而將光譜 進(jìn)行高階處理, 如求解二階導(dǎo)數(shù), 得到二階導(dǎo)數(shù)譜, 以將光譜曲線的差異放大。 對(duì)熒光光譜求二階導(dǎo)數(shù) 后, 光譜譜帶變窄, 二階導(dǎo)數(shù)光譜的極小值對(duì)應(yīng)熒光光譜峰值, 在定量測(cè)量上表現(xiàn)出很高的靈敏性[11] 。 圖 3(b)示出了三種液態(tài)生物氣溶膠和標(biāo)準(zhǔn)熒光組分色氨酸的二階導(dǎo)數(shù)譜, 可見(jiàn)二階導(dǎo)數(shù)的最小值, 與圖 3(a)中的熒光峰值位置一致。 此外, 二階求導(dǎo)后的譜曲線變得非常雜散, 不平滑, 這主要是由于被測(cè)物 濃度低, 受背景影響較大所致。

NADH 是反應(yīng)細(xì)胞呼吸和新陳代謝活動(dòng)的標(biāo)志之一。 圖 4 示出了經(jīng)降噪平滑和歸一化處理后的 4 種典型生物戰(zhàn)劑模擬物和標(biāo)準(zhǔn)熒光組分 NADH 在 NADH 熒光段的熒光譜曲線, 由圖 4(a)可知:

(1)所有菌的熒光譜譜形與 NADH 標(biāo)準(zhǔn)熒光譜的譜形較為一致, FWHM 約為 100 nm;

(2)由于 NADH 組分含量低, 加之熒光效率低, 強(qiáng)度弱, 故除標(biāo)準(zhǔn)熒光組分 NADH 的譜曲線較為光 滑外, 其他模擬物的熒光譜線的噪聲波動(dòng)較大, 熒光譜線不平滑, 在中心波長(zhǎng)附近, 存在寬度較窄的小尖 峰, 尤其是在大于中心波長(zhǎng) 450 nm 的譜段, 波動(dòng)較大, 毛刺嚴(yán)重;

(3)與氨基酸段的熒光類似, 所有營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌的熒光譜較標(biāo)準(zhǔn) NADH 熒光譜, 存在較為一致的紫移, 紫移了約 25 nm;

(4)由于熒光信號(hào)較弱, 大腸桿菌、 球芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)模擬物的熒光譜中還存在強(qiáng)度約為熒光強(qiáng)度 一半的瑞利散射信號(hào), 強(qiáng)度約為熒光強(qiáng)度 90%的 387 nm 氮拉曼信號(hào)和 403 水拉曼信號(hào)殘留;

(5)與氨基酸段熒光譜類似見(jiàn)圖4(b), 二階導(dǎo)數(shù)熒光譜放大了四種營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌二維熒光譜曲線的差 異。

4 結(jié) 論

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)場(chǎng)進(jìn)行了成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌四種生物戰(zhàn)劑模擬物的 培養(yǎng)和生長(zhǎng)曲線測(cè)定, 利用搭建的近場(chǎng)熒光測(cè)量激光雷達(dá)和配套的熒光測(cè)量腔, 測(cè)量得到了生物戰(zhàn)劑模擬 物營(yíng)養(yǎng)態(tài)的二維熒光光譜, 分辨率為 4 nm。

四種菌的生長(zhǎng)曲線與相關(guān)文獻(xiàn)存在一些差異, 主要是受培養(yǎng)環(huán)境, 如溫度波動(dòng)、 培養(yǎng)基和 pH 值等因素的影響;

四種營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌,  以及 BSA 和 OVA, 在氨  基酸段的熒光譜形與標(biāo)準(zhǔn)熒光組分色氨酸較為一致, 但受培養(yǎng)生化環(huán)境的影響, 熒光峰值均存在不同程度 的藍(lán)移/紫移, 其原因主要是細(xì)菌內(nèi)部熒光團(tuán)的疏水性增加, 極性變小, n→ π * 躍遷中, 熒光團(tuán)分子中的  基態(tài) n 電子與極性溶劑形成氫鍵, 使基態(tài)能量降低, 激發(fā)態(tài)與基態(tài)間的能量差變大, 導(dǎo)致熒光譜帶的藍(lán)移 /紫移。 僅從峰形上對(duì)不同物質(zhì)在氨基酸段的二維熒光譜進(jìn)行分辨是極為困難的, 將熒光譜進(jìn)行了二階求導(dǎo), 增大了譜形和分布的差異程度, 利用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法可以較好地進(jìn)行分辨識(shí)別, 下一步擬對(duì)二維熒光譜 進(jìn)行支持向量機(jī)建模, 對(duì)熒光譜應(yīng)用更高階的譜特征參量進(jìn)行識(shí)別。

經(jīng)培養(yǎng)后的成團(tuán)泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)態(tài)細(xì)菌氣溶膠存在 NADH   熒光峰, 但NADH 熒光強(qiáng)度較低, 導(dǎo)致不能有效地扣除水、 氮等物質(zhì)的拉曼散射分量和瑞利散射分量。同時(shí), 受激光器能量、 測(cè)量腔背景、氣溫氣壓等外部因素,  以及四種營(yíng)養(yǎng)態(tài)菌體內(nèi)生化成份的影響,    NADH 段的熒光峰波動(dòng)較大, 與標(biāo)準(zhǔn) NADH 熒光譜在譜形、中心波長(zhǎng)等參量上有較大差異。

The authors have declared that no competing interests exist.

參考文獻(xiàn)

文獻(xiàn)列表

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